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00μL,用涂布棒涂匀静置恒温箱培养:将涂好的平板用袋子装好倒置于30恒温箱中培养h.菌落纯化:,标记要纯化的菌落标30℃恒温培养箱倒置培养48h.结果计算:每克土样中微生物的数量等于同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品.3..6植株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定
挑取2环纯化好的植株体内分离的青枯雷尔氏菌于1.5mL离心管中,加入200μL无菌水,水浴10min,8000r离心1min,吸取上清液于-20℃保存.把纯化保存的似青枯雷尔氏菌落形态的单菌落的DNA用特异性引物pehA#3和pehA#6进行鉴定,引物序列为,pehA#3:5'-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3'和pehA#6:5'-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3'.扩增得到的片断大小为504bp.25μL的反应体系为:DNA模板10-20ng,Taq(5U/μL)0.3μL,10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP(10mM)0.5μL,引物pehA#3和pehA#6(10μM)各1μL加无菌水至25μL.PCR反应程序:96℃预变性1min,96℃变性30s,70℃退火30s,72℃延伸1min,2个循环,94℃变性30s,70℃退火30s,72℃延伸1min,33个循环,最后72℃下延伸5min.
3.结果与分析
3..1植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖数量
由图3-1,图3-2,图3-3可知,不同浓度FJAT-1458菌液在第6天在土壤的定植量达到最大,灌根浓度108cfu/mL在土壤中的定殖浓度最大.
图3-1不同浓度,不同天数FJAT-1458在土壤的定植情况Fig.3-1ThecolonizationsituationofFJAT-1458withdifferentconcentrationsanddaysinsoil
第12天104cfu/mL灌根浓度的土壤中已无分离到目标菌,第15天各浓度处理的土壤均无分离到目标菌.不同浓度FJAT-1458菌液在第6天在根的定植量达到最大,第18天各处理均无分离到目标菌.处理1在茎中无分离到目标菌,第12天处理2,3定殖量达到最大,第21天各处理均无分离到目标菌.在叶上各处理中均无分离到目标菌.处理2和处理3目标菌的定殖情况相差不大,因此可以选用处理2作为我们下一步试验的处理浓度.
图3-2不同浓度,不同天数FJAT-1458在根部的定植情况Fig.3-2ThecolonizationsituationofFJAT-1458withdifferentconcentrationsanddaysinroot
图3-3不同浓度,不同天数FJAT-1458在茎的定植情况Fig.3-1ThecolonizationsituationofFJAT-1458withdifferentconcentrationsanddaysinstems
3.4.2植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖数量比较
由图3-4,图3-5,图3-6可知,FJAT-1458在番茄幼苗不同生长期的土壤定殖量差异不大.在根部第6d定殖量达到最大,在茎部第12d定殖量达到最大,且2-3叶期的番茄苗的在茎部的定殖量明显高于5-6叶期的番茄苗.而在清水对照中的土壤及植株均无分离到青枯雷尔氏菌.
图3-4不同生长期FJAT-1458在土壤的定植情况Fig.3-4ThecolonizationsituationforFJAT-1458ofdifferentgrowthperiodsinsoil
图3-5不同生长期FJAT-1458在根部的定植情况Fig.3-5ThecolonizationsituationforFJAT-1458ofdifferentgrowthperiodsinroot
图3-6不同生长期FJAT-1458在茎的定植情况Fig.3-6ThecolonizationsituationforFJAT-1458ofdifferentgrowthperiodsinstems
图3-7灌根处理12d后番茄盆栽苗的生长情况Fig.3-7Thetomatopotgrowingafterinoculatingtwelvedayswithirrigationroot
3.4.3植株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定
由图3-8,3-9可知,分离到的目标菌在504bp处检测到了特异性条带,表明青枯雷尔氏菌已经成功在植株定殖.
图3-8FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖量的检测Fig.3-8MolecularidentificationofFJAT-1458colonizationcontentindifferentpartsoftomatoplant
M:3000bpMarker,+Ralstoniasolanacearum,-:CK,Serialnumber:Unidentifiedstrains
图3-9FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖量的检测Fig.3-8MolecularidentificationofFJAT-1458colonizationcontentindifferentgrowthperiodsoftomato
M:3000bpMarker,+:RalstoniasolanacearumGMI1000,-:CK,Serialnumber:Unidentifiedstrains
3.5讨论
当外源生防菌株施用到植物根围后,不同微生物在根系土壤中的定殖,侵染方式也不一样.祝明亮等[]的研究表明,淡紫拟青霉的定殖在不同时期,不同品种中均有区别.生防菌同土壤中微生物竞争能力的强弱是其在土壤中存活的关键.Bull等[]研究了荧光假单胞生防菌株2-79在小麦根部不同部位定殖量与小麦全蚀病病斑数之间的关系证明生防菌株2-79的定殖量与寄主植物病斑数成反比定殖量越大病斑产生的数量越小.当根部定殖量达到107-108cfu/时几乎不产生任何病斑.黎起秦等[]报道枯草芽孢杆菌B47在番茄植株根和茎中定殖量达到104cfu/g的时候其对番茄青枯病的防治效果能够达到79.79%.这表明对生防菌定殖的研究是研究植物病害生防效果的前提.
通过对定殖浓度筛选表明,定殖浓度必需达到一定的大小,才能在植株体内有效的定殖,而106cfu/mL和108cfu/mL在植株的定殖量差别不大.比较的定殖差异,表明植株幼苗越小越有利于的定殖.这可能由于植株幼苗的根系生长较快,且根系较嫩,青枯雷尔氏菌更容易侵入到植株体内.植株青枯病苗期就开始发病,初果后发病严重可能同青枯雷尔氏菌的侵入特征有联系.因此在防治植株青枯病的时,应选择在幼苗期对其进行防治,这样能起到更好的效果.结果表明,cfu/mL,其在番茄植株体内的定殖时间只有12d,且只在植株根部定殖,在茎和叶均无定殖.当植物疫苗工程菌FJAT-1458接种浓度为106cfu/mL和108cfu/mL,其在番茄植株体内的定殖时间可达18d.当接种浓度为106cfu/mL时,接种的番茄植株苗龄越小,工程菌FJAT-1458在番茄植株及根系土壤的定殖量越大,这为无致病力菌株的开发利用提供了理论依据.细菌的定殖一般情况下同可细菌的鞭毛和菌毛密切相关如假单胞属细菌必需靠鞭毛才能在各种表面定殖,细菌的游动性也主要是通过鞭毛来实现的[].细菌的定殖还同细菌的趋化性有关,这种趋化性信号途径是有一系列基因编码的[].植物
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