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340;无致病力青枯菌,温室盆栽试验筛选得到2株有较好控病效果,防效分别为43%和47%.陈庆河等[]用紫外诱变法获得的两株青枯无致病力菌株盆栽试验结果表明,番茄经无致病力菌株AimO44和ASp061处理后,均可推迟发病,20d后的防效分别为56.7%和53.4%.田间小区试验15d后对青枯病的防效分别为53.8%和37.7%.肖田[]分离到的无致病力青枯雷尔氏菌菌株Tmjdl-3和Aujds-2-1对烟草青枯病温室控病效果较好,20d后的相对防效分别为58.4%和97%.因此,研制出一种对植物不会产生大的过敏反应,能够长期存在植株体内且具有较高防效的无致病菌株作为植物疫苗具有重大意义.该疫苗如果研制成功,可显着缩减农作物药物成本,具有广泛的应用前景.本研究的目的及意义
生物防治对作物生产的可持续发展具有较好的应用前景,而无致病力青枯雷尔氏菌是作物青枯病生防材料的重要来源.利用无致病力青枯菌防治青枯病的优点是,其能在与青枯菌相似的生态条件下发挥生防作用,且对生态环境影响不大.从上世纪年代开始植物病理学家就开始了无致病力青枯菌对青枯病控病可能性和机理的研究,到目前为止,虽没有无致病力青枯菌的产品问世,但在青枯病控病试验中短期防效表现良好,具有一定的生防潜力.对于青枯无致病力菌株对青枯菌的拮抗机理,目前主要存在有两种观点一是认为交叉保护和诱导寄主产生抗病性,使寄主植物产生过敏性反应二是认为无致病力菌株产生了细菌素.但对于细菌素对青枯菌的作用机制也存在两种观点,有的认为细菌素具有抗生作用,可以抑制青枯菌的生长和繁殖,从而降低病原菌的数量,减少了病原菌的侵入机会,有的学者认为细菌素的作用是诱导寄主对青枯病产生抗病性.
植物疫苗FJAT-1458是福建省农业科学院刘波研究小组从病区番茄植株分离获得一株青枯病防效较好的疫苗菌株.课题组对该生防菌的形态特征,生化特性,大田试验等进行了大量研究,并研制出植物疫苗鄂鲁冷特为了进一步了解植物疫苗FJAT-1458的生防机理本试验研究了番茄青枯病植物疫苗植物疫苗FJAT-1458的免疫抗病机理有重要意义.
第二章番茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选
2.1引言
番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种毁灭性土传病害[3],在我国四川,浙江,福建,江西,广东,广西等省区发病较重,造成农业生产巨大的经济损失,其防治工作一直备受关注[,87].由于青枯雷尔氏菌在土壤中的存活时间长,传播快,尚无理想的防治措施.化学防治污染环境,危害人类健康,且未发现有效的化学药剂采用轮作可起到一定的防治作用,但实施比较困难[],抗病育种概率小,难度大,尚未见有成功的报道[].利用青枯雷尔氏菌的弱株系作为植物疫苗来防治番茄青枯病是一种新的尝试.
作植物疫苗.不同接菌浓度和不同接菌天数对番茄青枯病生防效果的影响最佳施用浓度和最佳施用时间,为青枯病植物疫苗的.
2.2试验材料无致病力和强致病力均由福建省农科院农业生物资源所微生物研究中心菌种资源库.供试菌株表1不同寄主青枯雷尔氏菌菌株及来源
Tab2-1SourcesofRalstoniasolanacearumfromdifferenthostplants
菌株编号菌株致病性FJAT-1458番茄南平建瓯FJAT-1444姜南平建瓯FJAT-1465番茄南平建瓯FJAT-1452番茄南平建瓯FJAT-1442姜南平建瓯FJAT-1441姜南平建瓯FJAT-91番茄福州闽侯FJAT-T21番茄FJAT-91致弱AFJAT-T6番茄FJAT-91致弱AFJAT-T5番茄FJAT-91致弱AFJAT-T4番茄FJAT-91致弱AFJAT-T2番茄FJAT-91致弱AFJAT-T33番茄FJAT-91致弱AFJAT-T7番茄FJAT-91致弱AFJAT-T1番茄FJAT-91致弱AFJAT-T8番茄FJAT-91致弱AFJAT-T11番茄FJAT-91致弱AFJAT-T12番茄FJAT-91致弱A"V":irulentRalstoniasolanacearumstrain,"A":AvirulentRalstoniasolanacearumStrain供试品种:选用的番茄品种为金石王1号,番茄种苗购自厦门如意集团农业科技有限公司.
2.试验方法
2..1番茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选
(1)番茄植株培养:将番茄种苗移栽至盆钵种植,盆钵直径15cm,高10cm,每盆装无菌土3kg,每盆移栽1株番茄苗(选择长势一致的苗),30℃)培养,备用.
(2)菌液的制备将供试菌株TTC培养基上活化,挑取单菌落于SPA培养液中,置于30℃,200r/min摇床上培养24h,×106cfu/mL,采用伤根接种法[],用灭菌手术刀在番茄苗根部周围的根系划2刀伤根后灌根接种无致病力青枯雷尔菌,50mL/盆,处理盆无致病力青枯雷尔菌3天后FJAT-91,3d后观察植株发病情况无致病力青枯雷尔氏菌植株发病无致病力青枯雷尔氏菌2.3.2番茄青枯病植物疫苗番茄青枯病防效的FJAT-1458作为植物疫苗TTC培养基上活化,挑取单菌落于SPA培养液中,置于30℃,200r/min摇床上培养24h,不同接种浓度处理稀释(1×108,1×107,1×106,1×105,1×104cfu/mL)接种于6-7叶龄的番茄根部,50mL/盆,每种浓度,对照.3d后灌根接种FJAT-91,接种浓度为1×106cfu/mL
(3)防效比较:统计不同接种浓度的工程菌FJAT-1458处理后番茄植株发病.番茄青枯病植物疫苗番茄青枯病防效的将植物疫苗TTC培养基上活化,挑取单菌落于SPA培养液中,置于30℃,200r/min摇床上培养24h,确定原始浓度的无致病力青枯雷尔氏菌株,用无菌水进行10倍系列稀释,制备试验所需浓度的菌液,备用.不同接种浓度处理:灌根法接种番茄青枯病工程菌FJAT-1458灭菌手术刀在番茄组培苗根部周围的根系划2刀,然后用浓度为1×106cfu/mL的FJAT-1458间隔时间(0d,3d,6d)灌根接种于6～7叶龄伤根的番茄根部,CK1,CK2组在伤根后用清水代替菌液.2)第6d灌根接种浓度为1×106cfu/mL的强致病力FJAT-91菌液CK2组用清水代替菌液.观察番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458不同番茄青枯病生物防治能力.
2..4番茄青枯病植株病原菌的的植株预处理:植株先用清水清洗,用滤纸将植株水分吸干.称样及样品处理:称取根,茎基部,茎中部,茎顶部,叶各1g,先用75℅酒精消毒30s再用10℅的NACLO消毒5min,然后用无菌水清洗3遍,再用灭菌滤纸将样品吸干,放至装有10mL无菌水的研钵,充分研磨,即配成10-1浓度,稀释样品原液:吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管,即配成10-2浓度,依次稀释配置成10-3.平板涂布:,在振荡器上振荡1-30s,菌液混合均匀吸取200μL,用涂布棒涂匀静置恒温箱培养:将涂好的平板用袋子装好倒置于30℃恒温箱中培养h.菌落纯化:,标记要纯化的菌落标30℃恒温培养箱倒置培养48h.
采用水煮法提取上述分离的病原菌DNA.特异性引物pehA#3和pehA#6进行鉴定,引物序列为,pehA#35'-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3'和pehA#65'-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3'.扩增得到的片断大小为504bp.25μl的反应体系为:DNA模板10-20ng,Taq(5U/μl)0.3μl,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTP(10mM)0.5μl,引物pehA#3和pehA#6(10μM)各1μl加无菌水至25μl.反应程序:首先96℃1min,然后按96℃30s,70℃30s,72℃1min程序2个循环,再按94℃30s,70℃30s,72℃1min程序33个循环,最后72℃下延伸5min.
2.3试验结果
2.3.1番茄青枯病植物疫苗菌株的筛选
分别以强致病力青枯雷尔氏菌
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