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[摘 要]探讨免疫组化室内质量控制的标准化管理,根据本科室免疫组化质量控制管理实际,从实验前、实验中、实验后三方面阐述免疫组化质量控制标准化管理细则,总结在实验过程中的经验和体会,提高免疫组化检测结果的准确性和可靠性.
[关 键 词]免疫组化；质量控制；标准化管理
[中图分类号]R446.8[文献标识码]C[文章编号]1673-9701（2013）31-0134-03
免疫组化染色技术在现代病理诊断中的应用日益广泛,对各类肿瘤的确诊及鉴别诊断具有重要意义,而且在肿瘤患者个体化治疗、靶向治疗方案的选择及预后判断方面越来越受到临床医生的青睐,已经成为病理诊断中不可或缺的辅助手段[1].因而很多单位,包括基层医院也开展了这个项目.随之而来的是,免疫组化质量控制问题也凸显出来了.这其中有实验员操作不当的因素,也有其他的因素,如组织固定不好、试剂效价和试剂盒质量问题等等,各免疫组化实验室质量管理水平参差不齐[2,3].目前国内尚无免疫组化标准化管理的统一标准,因而在众多繁杂的条件中,探索找到一个相对稳定的免疫组化质量控制的条件,即所谓的标准化管理方法具有重要意义.笔者根据本科室的实际情况,总结免疫组化室内质控管理的一点心得体会,从实验前、实验中、实验后三方面浅谈免疫组化室内质量控制如何实现标准化管理.
1实验前的标准化管理
1.1组织处理的标准化
组织处理得当是成功制片的关键,对免疫组化染色结果的影响尤其重要,主要包括取材、固定、脱水等环节.如果组织处理不良,那么在其后的任何阶段均难以补救.组织或细胞固定的目的是使细胞内蛋白质凝固,终止或减少外源性或内源性酶的反应,防止细胞自溶,以保持组织细胞的固有形态和结构,更重要的是保存组织或细胞的抗原性,防止抗原的丢失或弥散.因此,标本应尽可能保持新鲜并及时进行固定.我们科室积极与临床一线沟通,宣传固定的意义、方法和要求,拟定以下标准：手术标本离体后30分钟内,用10%
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1.2免疫组化切片的标准化
1.2.1玻片处理及切片厚度用于免疫组化的玻片一般都需要进行防脱片涂胶处理,目前常用的有氨丙基三乙氧基硅烷和L-多聚赖氨酸,防脱片的效果对比其他粘附剂都要好[5].我们采用的是L-多聚赖氨酸,效果很好.采用3～4μm连续切片[6],切片厚度不能过于求薄,太薄由于抗原的减少,会导致抗体阳性表达的减弱,也不宜太厚,太厚在热修复过程中容易导致脱片.
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1.2.2抗原修复方法福尔马林固定组织导致组织中抗原决定簇封闭,也就是组织细胞经福尔马林固定后,导致抗原决定簇的三维结构发生异常改变,使抗原决定簇被掩盖或原来位于表面的一些抗原决定簇因折叠而形成隐蔽的抗原决定簇,因此抗原的理化性质发生了显著的变化,表位空间结构改变导致许多抗原免疫活性丢失.但这一变化是可逆的,可通过抗原修复.目前抗原修复有两种方法：酶消化法和热修复法.
抗原修复方法的选择关系到组织抗原能否暴露充分,这对免疫组化染色结果有很大影响.有很多文献比较了各种抗原修复方法的优劣,目前,被认为效果最好、最常用的修复方式为高压加热修复[7-9].我们将微波加热与高压加热的方法进行比较,发现阳性定位于细胞核的抗体,如P53、Ki-67等的核表达,在高压修复后明显强于微波修复,因此我们选择高压加热修复,抗原修复液为柠檬酸盐,修复时间为高压锅出气后2min自然冷却,时间过短,抗原暴露不够,时间过长,导致背景过深.
1.2.3抗原修复液的选择加热抗原修复缓冲液有多种如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、Tris（pH7～8）、EDTA（pH8.0）等,目前首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）,优点是染色背景清晰,适合于大多数抗体.Tris和EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强,但其染色背景同时加深,如使用不当易造成假阳性结果.值得注意的是,没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体,柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液,但也不能除外某些抗体适于用EDTA和Tris缓冲修复液.一般抗原比较难于表达的抗体多选择后两者.
1.3试剂管理的标准化
1.3.1试剂清单及使用记录的管理试剂的种类、公司有很多,为了方便管理,我们创建了一个“免疫组化试剂登记表”Excel电子表格,进行试剂清单的管理,简洁又规范（图1）.登记表的内容包括抗体名称、类型、稀释度、是否修复、克隆号、编号、批号、公司名称、库存量、有效期、接收日期、启用日期、用完日期等,也可以根据各单位实际情况自己添加内容.所有试剂应保证在有效期内使用,只有这样才能确保抗体的效价.因此,登记表中有效期、用完日期的记录要求完整准确,过期试剂或者失效试剂应丢弃不用,并备注原因.每种试剂的使用情况都要记录在案（图2）,与图1表格建立超链接.下图1为本科室免疫组化试剂登记表部分的截图,利用Excel条件格式将不同字体颜色显示不同指代意义,如红色提示超过有效期等.
图1免疫组化试剂登记表（部分）
图2试剂盒使用记录表（图1中超链接）
1.3.2冰箱温度控制及试剂的摆放所有的试剂均应在试剂公司建议的温度下保存,储存试剂的冰箱应每天检查,建立一个冷藏冰箱温度监测表,并按时记录温度值.不管是浓缩型还是即用型试剂,如果是一堆地放在冰箱里,要用或配置的时候找起来比较麻烦费事,我们自己设计制做了几个试剂摆放的木架子,将免疫组化试剂按首字母A→Z排列,同系列的按数字从小到大依次排列,如Actin、AFP、Bcl-2、CA125、CD10、CD117等依次排列（如图3所示）,这样找试剂比原来方便许多,节省时间,看起来也比较整洁.图3试剂的摆放
图4阳性与阴性对照
1.3.3试剂配置免疫组化的试剂分为即用型和浓缩型两种,浓缩试剂的配置,需要对抗体滴度（稀释比）进行评估.我们参考公司推荐的抗体滴度,在其前后各增加一个实验滴度,如公司推荐1∶200,我们配置1∶100、1∶200、1∶400三种滴度,进行预实验,以观察阳性细胞染色强度及非特异性染色,验证试剂的可靠滴度,然后才能在常规的实验中应用.
2实验中的标准化管理
2.1检测方法的选择
免疫组化的检测方法有很多种,大致分为生物素型和非生物素型两大类.因组织中含有内源性生物素,所以会干扰免疫组化的染色结果,在生物素型检测方法的操作过程中,要阻断内源性生物素干扰.非生物素型聚合物检测,可以有效地防止内源性生物素的影响,并且灵敏度高,操作简便,为很多实验室采用,是目前免疫组化标准化染色的首选方法.我们采用的是非生物素型EliVision二步法,检测方法比较稳定,效果也好.
2.2免疫组化染色操作标准化
目前,免疫组化染色分手工操作和全自动免疫组化仪操作.在手工染色过程中,或多或少要受到实验员个人因素的干扰.全自动免疫组化仪的出现,避免了操作过程中人为因素的干扰,增加了染色结果的可靠性,有助于免疫组化质量控制的标准化管理.我们采用全自动免疫组化仪进行染色,与手工染色相比,具有以下技术优势：①精确的抗体孵育时间控制,确保染色质量,避免背景非特异性着色.②精确的抗体浓度以及量的控制,避免因实验员手法不同而导致抗体浓度被稀释,影响染色强度的表达,还可以避免交叉污染和非特异性染色的产&#
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