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橡胶树有关论文范文检索,与橡胶树AFLP体系的相关毕业论文题目范文

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【摘 要】以197个橡胶树杂交群体样本为材料,通过对影响AFLP技术的多种关键因素进行研究,建立了一套适合橡胶树的AFLP技术优化体系.其中优化的关键的因素为:(1)酶切-连接时DNA模板为250ng,反应体系采用各3UEcoRI/MseI/T4连接酶.反应时间为10h;(2)预扩增模板为稀释一倍的酶切连接产物,用量为1μL;(3)选择性扩增要用稀释倍数为40倍的预扩增产物.本研究为橡胶树遗传图谱的构建及育种的辅助选择提供有力的工具.

【关 键 词 】橡胶树,限制性内切酶,AFLP,银染

AFLP[1]技术,又称扩增片断长度多态性,是基于RFLP和PCR相结合的DNA分析技术.AFLP多态性强,非常适合遗传多样性分析[2]、快速遗传图谱构建等研究.橡胶树是多年生的高大乔木,普通育种期一般要经过8年的时间,常规育种的选育和改良品种技术对于橡胶树的更新换代是很难突破,现代分子生物学技术的出现,尤其是近代DNA基因改良技术的出现,加快育种目标的实现成为可能.用AFLP分子标记技术为橡胶树高产育种提供相应的分子辅助手段.但操作技术要求上高于其他方法由于该技术实验步骤比较繁杂,有许多因素会直接影响AFLP分析的效果.为了加快对橡胶树的研究,现代分子生物学也进入橡胶树育种的领域.为了使更好地把分子生物学应用在品种鉴别及辅助育种等工作上,建立起一套适合于橡胶树基因组AFLP标记分析的技术体系对于开展橡胶树遗传图谱的研究有着实践意义,为使AFLP研究分析结果更可靠、更准确,对橡胶树基因组AFLP分析的DNA模板构建和银染技术体系分别进行了分析和改良,进而使适合于橡胶树AFLP的研究体系更加完善.


为什么要写橡胶树毕业论文
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1.仪器与材料

仪器:恒温水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、垂直电泳槽.

材料:橡胶树杂交群体样本群体((873×GT1)样品、EcoRI \MseI接头、引物、Tag酶、EcoRI内切酶 \MseI内切酶\T4-DNA 连接酶及dNTP.


该文来源 http://www.sxsky.net/moban/425787.html

2.AFLP体系分析

2.1 酶切连接体系DNA模板制备

采用EcoRI、MseI双酶切组合, DNA模板片断与引物接头的连接.每个DNA模板样品酶切连接反应体系中混合液总体积约为20μL.如图(1)各成份加入后混匀,在恒温水浴锅37℃酶切连接12h过夜.取6μL酶切产物在琼脂糖凝胶(2%)检测结果.

Table1 完善酶切连接体系 Table2完善预扩增体系

2.2 预扩增体系

将连接完成后的DNA样品用0.1×TE稀释1倍后,进行预扩增.预扩增的反应体系为20μL,加入如图(2)所示10×buffer和酶切连接稀释后的DNA产物,MSeI引物(M00)和EcoRI引物(E00), Taq酶.各成份加入混合后在BIOMITRA- T1热循环仪上进行.热循环参数设置为:

(1)94℃3 min-(2)94℃30sec-(3)56℃40sec-(4)72℃80sec(goto step 2-30 cycles)-(5)72℃5 min

整个循环为30,扩增生成物在琼脂糖凝胶(2%)跑电泳,然后检测结果.

2.3 选择性扩增

用稀释20倍的0.1×TE用于对预扩增产物进行选择性扩增,用于选择性扩增的体系为20μL, 选择扩增引物dNTP、10×PCR butter, DNAMSeI/EcoRI Taq酶以及预扩增稀释后的产物.混匀放入热循环仪上进行扩增.热循

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环仪器上的参数设置为:

(1)94℃3min-(2)94℃30sec-(3)65℃40sec(-1℃ /cycle)-(4)72℃80sec(goto step 2 10cycles)-(5)94℃30sec-(7)56℃30sec-(8)72℃ 75sec(go to 5 23cycles)-(9)72℃5min

Table3 选择性扩增产物

产物4℃冰箱保存备用.

3.选择性扩增产物的检测

在清洗玻璃板后紧接灌胶,然后上样后电泳.等电泳完后进行银染检测.检测步骤为脱色、染色、显影、终止显影,最后使胶板干燥.将显影后的胶板置于室温下,自然干燥,干燥后用计算机图像扫描仪扫描或数码相机拍照保存图片.

4.结果与讨论

在AFLP分析中采用MseI和EcoRI对基因组DNA进行双酶切,采用筛选出的引物组合Mse+C和EcoR+A进行预扩增对于选择性扩增则采用EcoR+ANN和/Mse+CNN带三个选择性碱基引物组合,选用合适的引物,快速银染法进行染色,经过电泳后,每个泳道中可以得到20-90条清晰的条带,说明Mse和EcoR双酶切组合以及完善的各步骤对于橡胶树基因组进行AFLP体系扩增是比较好的.

对AFLP分析的准确度关键是在酶切的选择,基因组比较大,同时GC含量又低,这样橡胶树基因组的适宜选择识别位点应该富含AT的内切酶组合.这样对橡胶树基因组DNA酶切才能达到好的效果,预扩增的目的是为选择性扩增提供大量的模板,同时对模板起到选择性纯化的作用,因此在预扩增反应中采用EcoR+AMse+C的引物组合,使选择性扩增能产生易重复、清晰、稳定的条带.而对于引物中选择性碱基的数目直接影响着扩增条带的条数,选择性碱基数目多则扩增条带数就会越少,就不利于多态性的分辨和检测,达不到检测的效果.反之扩增的条带丰富但不易分辨.因此 引物中选择性碱基的数目要选用合适.

经过有效的扩增之后,还要有凝胶检测技术要高,只有染 才可以分辨出条带,才可以出现均匀地色泽清晰的图谱,长时间的摸索,有以下8点在银染技术中要值得注意.(1)玻璃板要用酒精洗干净然后自然风干;(2)要至少要2h的时间确保凝胶聚合好;(3)控制适宜的变性温度范围,一般情况下92~95℃变性后产物在凝胶上均匀分布;(4)电泳过程中功率要合适,电泳时要在42~46W,整个电泳过程最好能保持恒定功率,电泳过程中可以使温度控制在41℃-54℃范围内,这样可使带型更加清晰;(5)银染显色的全过程中一定使用去离子水,不能有杂质,否则条带不清晰;(6)配置的硝酸银溶液一定要使硝酸银充分溶解并摇匀,才可以将跑过凝胶的玻璃板放入银染溶液中,否则硝酸银颗粒会嵌入凝胶中呈 斑点,不利于条带的显现;(7)经过银染夜之后,放入去离子水中漂洗时间不能太长,控制在3s-5s即可;(8)采用预冷的碳酸钠溶液不能低于4度,当凝胶板上的条带清晰可分辨时就立即取出及当主带纹清晰可见后,应立即定影.

【参考文献】

[1]Zabeau M,Vos P.Selective restriction fragment amplication a general method for DNA finger pminting[p].European Patent Application Number 92402629.7, Publication Number EP 0534858 A 1.European Patent Office, Paris,1993.

[2]BARRETT P A,KIDWEEL K K.AFLP-based geics diversity assessment among wheat cultivars from the pacific north- weat[J].Crop Science, 1998,38:1261-1271.


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