印迹有关毕业论文的格式,与疾病标记物分子印迹技术在分离传感中的应用相关论文答辩ppt模板

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摘 要 ：疾病标记物分子印迹聚合物以疾病标记物为模板分子,可实现低浓度和基底复杂的疾病标记物的高效分离和富集.以疾病标记物分子印迹聚合物为敏感元件构建的传感器,可用于对威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病进行筛查和诊断.本文介绍了分子印迹技术的原理和方法,重点介绍了疾病标记物分子印迹中常用的印迹方法、印迹材料、以及疾病标记物分子印迹聚合物在疾病标记物分离及传感中的应用.

关 键 词 ：分子印迹； 疾病标记物； 分离； 传感； 评述

1引言

疾病标记物是指当身体出现疾病时在血浆或其它体液中能够检测到的物质,是指示疾病存在的生物化学指标.然而,很多疾病的早期症状不明显,当采用常规方法确诊疾病时,往往已发展到晚期,不利于疾病的早期诊断和患者的长期生存.因此,疾病标记物的筛查及其早期检测,对疾病诊断、药物选择、判断分期、实现个体化治疗以及预后具有重要意义.目前,疾病标记物的检测以免疫分析法为主,包括酶联免疫分析法、电化学发光免疫法、放射免疫分析法等[1].然而,以上方法往往存在操作繁琐、影响因素多、甚至放射性污染等问题,使得其在疾病标记物早期检测和普及应用等方面受到一定限制.因此,疾病标记物的特异性和灵敏性检测新方法成为研究热点.

分子印迹聚合物（Molecularly imprinting polymers, MIPs）具有制备方法简单、成本低、易于大规模制备、能耐受酸碱等复杂环境等优点,可作为模拟抗体和受体[2]、吸附分离材料[3]、仿生化学传感器的敏感元件[4]、选择性催化剂[5]等,在分离富集、化学传感、药物控释和催化等领域有良好的应用前景[6].Vlalakis等[7]以MIPs代替常规抗体,对药物中的吗啡和茶碱进行了放射免疫分析,不仅交叉反应结果可与生物单抗相媲美,而且抗茶碱分子印迹聚合物对病人血浆中茶碱的定量分析结果也完全符合医学检测要求,表明印迹聚合物抗体和受体可以作为生物抗体的理想替代品和有益补充.Sellergren等[8]首次将分子印迹技术用于固相萃取领域,以AIDS抑制药戊脒为模板分子制备分子印迹聚合物,并将其填充于色谱柱中,用于对尿样中戊脒的高效分离,解决了传统固相萃取法难以实现复杂基质中戊脒有效分离的难题.Greene等[9]采用分子印迹技术构建了可同时识别7种不同芳香胺化合物的比色法阵列传感器,首次实现了结构相似且没有光活性的多组分药物的同时分离检测.

近年来,分子印迹聚合物模拟天然受体在胆固醇、多肽、蛋白质等疾病标记物识别检测等方面取得了较好的研究进展,引起了广泛关注[10].以疾病标记物为模板分子,将分子印迹技术应用于疾病标志物的识别和检测,将为实现疾病的早期诊断提供新途径.本文概述了分子印迹技术的发展概况、原理和方法,介绍疾病标记物印迹中常用的印迹方法和印迹材料,重点介绍胆固醇、甲胎蛋白、癌胚抗原等疾病标记物分子印迹聚合物在分离、富集和传感中的应用.2分子印迹基本原理

20世纪40年代,Pauling提出以抗原为模板合成抗体的理论,其中结合位点应和空间匹配的观点成为分子印迹的基本思想.1949年Dickey发现,在合成硅胶时加入甲基橙,可使硅胶对甲基橙的吸附量增加,由此提出了“专一性吸附”的概念,这一研究被视为“分子印迹”的萌芽[11].1973年,Wulff等[12]首次以D甘油酸和D甘露醇的乙烯基衍生物为模板分子,采用共价印迹法合成了对糖类化合物有良好选择性的分子印迹聚合物,利用洗脱D甘油酸和D甘露醇分子后形成的印迹空腔,分别实现了甘油酸分子和甘露醇分子的手性拆分.但是,共价型模板聚合物的动力学过程较慢,不适合目标分子的快速识别.1984年,Morrlow等[13]创立了非共价型分子印迹法（分子自组装法）,模板分子和功能单体之间以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体模板分子复合物,经过交联、聚合后将模板分子和功能单体之间的相互作用保存下来,该法可在温和条件下洗脱模板分子,对客体的识别和释放速度快.然而,非共价法印迹过程的轮廓不够清晰,大量功能单体的存在还降低了聚合底物的选择能力.Whitbe等[14]发展了共价与非共价印迹杂化体系法（牺牲空间法）,即聚合时采用共价键方式将模板分子和聚合单体结合,对客体分子识别时则采用非共价键结合方式,采用这种方法得到的分子印迹聚合物既有共价印迹聚合物亲合专一性强的优点,又有非共价印迹操作条件温和的优点,因此,牺牲空间法引起了广泛的研究.分子印迹技术以其通用性和立体专一性得到了世界瞩目并迅速发展起来.分子印迹技术根据目标模板分子的大小、空间结构和电荷分布,选择合适的功能单体和交联剂,功能单体和模板分子通过分子间作用形成单体模板分子复合物,用交联剂交联聚合后形成交联聚合物,将功能单体在特定的空间取向上固定下来；通过物理或化学手段再将模板分子从交联聚合物中洗脱,在聚合介质中保留下模板分子的“印迹”或留下“记忆”,形成具有在空间构型和结合位点上与模板分子相匹配的空腔；由此形成的MIPs具有特异性的识别功能基团和与模板分子空间结构互补的多重作用位点,对模板分子有较高的亲和力和特异性结合能力,可实现对混合物中目标分子的有效分离和特异性识别.

3疾病标记物印迹聚合物制备

3.1印迹材料

疾病标记物是生物分子,当远离生物环境时容易变性失活.因此,在合成疾病标记物分子印迹聚合物的过程中,选择合适的功能单体、交联剂和溶剂,对提高分子印迹聚合物对模板分子的亲合力、选择性、增强识别位点的有效性和数量等十分重要.根据印迹材料化学性质的不同,可将常用的合成疾病标记物分子印迹聚合物的材料分为有机材料和无机材料.

3.1.1有机材料含有不饱和双键的有机化合物（甲基丙烯酸、4乙烯基苯硼酸、丙烯酰胺等）是制备分子印迹聚合物最常用的功能单体.这类功能单体利用正负电荷之间的静电作用、氢键作用、疏水作用或金属螯合作用与目标分子进行结合,在交联剂存在下,通过加热、光照或氧化等方式引发聚合,形成有机聚合物,由此制备的分子印迹聚合物具有良好的热稳定性和耐酸碱能力.有机类功能单体种类繁多,研究者可根据模板分子物化性能的不同选择合适的功能单体,从而提高印迹聚合物的稳定性,改善印迹腔体的识别性能.张圣祖等[15]以N十八烷基马来酰胺酸为凝胶剂,在甲基丙烯酸怍且阴ァ⒓谆┧帷⒕垡叶级谆┧狨ズ湍0宸肿 3胆固醇酰氧基丙酸混合物中进行自组装,形成稳定的超分子有机凝胶,经紫外光原位聚合形成有机聚合物,再以乙腈为洗脱剂提取模板分子3胆固醇酰氧基丙酸,制备了用于识别胆固醇的非共价印迹聚合物.Miyata等[16]将凝集素刀豆蛋白A（ConA）和多克隆抗甲胎蛋白（AFP）抗体分子分别与N丙烯酰氧琥珀酰亚胺作用,制备成乙烯基修饰的凝集素ConA和乙烯基修饰的多克隆抗甲胎蛋白抗体分子,再将乙烯基修饰的凝集素ConA与丙烯酰胺反应制备丙烯酰胺嫁接的ConA,并以丙烯酰胺嫁接的ConA和乙烯基修饰的多克隆抗甲胎蛋白抗体分子为共同配体,N,N′甲叉双丙烯酰胺为交联剂,制备了动态识别肿瘤特异性标志物AFP的糖蛋白凝胶,洗脱模板分子后形成含有AFP印迹空腔的蛋白凝胶.当再结合AFP分子时,凝胶体积收缩,根据凝胶体积的改变实现AFP分子的特异性识别和检测,MIPs对AFP识别具有良好的特异性,而且无需复杂的前处理过程,对肝癌的临床诊断具有重要意义. 3.1.2无机材料分子印迹无机材料主要以四烷氧基硅烷或有机物官能团修饰硅氧烷和四烷氧基硅烷为共同前驱体,在液相条件下与模板分子均匀混合,经水解和缩合形成稳定透明的溶胶体系,陈化后形成三维网络结构的凝胶,经干燥和固化后形成干凝胶.该方法制备的凝胶具有大的表面积、均匀的孔径、良好的热稳定性和光通透性,而且,通过改变前驱体和操作条件还可简单地实现其物理化学性质的调节.Gupta等[17]以硅酸盐衍生物溶胶凝胶为基质,采用水解和非水解两种方式制备了胆固醇分子印迹聚合物,由氮气吸附解析曲线计算的MIPs总孔径体积值表明,以上两种方式合成的溶胶凝胶基质均具有多孔性,同时,MIPs的BrunauerEmmettTeller（BET）特异性表面积值还表明MIPs具有较大的比表面积.对两种方法合成的MIPs重结合胆固醇分子的能力及孔径、比表面积等的比较结果表明,采用水解法合成的胆固醇分子凝胶具有更好的水溶性和热稳定性,表面吸附及重结合百分比均比非水解方法合成的印迹聚合物高.然而,有机硅氧烷的官能团比较单一,制备的印迹聚合物对模板分子的特异性识别能力较差.Soares等[18]先将胆固醇分子和饣泛旌希偌尤胨囊已趸柰橹票傅ü檀 饣泛枘河3.2分子印迹方法

传统的MIPs制备方法是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定配比溶解在溶剂（致孔剂）中,在适当条件下引发聚合,得到高度交联的块状刚性聚合物,然后经粉碎和筛选,得到尺寸合适的颗粒,洗脱模板分子后形成含有特异性识别模板分子空腔的粒子.Yavuz等[19]以N甲基丙烯酰L酪氨酸甲基酯为功能单体,偶氮二异丁腈为引发剂,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,胆固醇为模板分子,合成了胆固醇印迹聚合物,用氯仿洗脱模板分子后,利用含有印迹空腔的印迹粒子实现了样品中胆固醇分子的特异性检测.虽然这种块体印迹法所需装置简单,普适性强,但块体印迹法存在研磨过程可控性差、模板分子洗脱困难、印迹位点不均一等问题,使得印迹粒子对目标分子的重结合效率低.为了解决以上问题,表面分子印迹法应运而生.表面分子印迹法是在或接近载体的表面上生成与模板分子相互作用的结合位点,有利于模板分子的快速洗脱和高效重结合,不仅解决了传统方法对模板分子包埋过深或过紧而导致的无法洗脱等问题,还大大提高了印迹分子与MIPs的结合速度.Wang等[20]将直肠癌特异性标记物癌胚抗原（CEA）与烷基硫醇混合,通过金巯键作用在金覆盖的硅片表面形成自组装单分子层,洗脱模板分子后形成的CEA印迹位点能够特异性结合CEA分子.将上述制备的传感元件与电位计连接,通过CEA印迹位点重结合CEA分子时电位的改变实现对直肠癌细胞培养液中CEA的检测,获得了与酶联免疫法相一致的结果.由于CEA分子印迹于烷基硫醇自组装单分子层表面,大大减小了洗脱模板分子的时间及难度,重结合CEA分子时,电位达到稳定读数的时间仅需2～10 min,分析时间明显缩短.但是该方法的制备过程远不如传统的本体聚合简单、方便、直接.利用纳米印迹法合成的聚合物使识别位点充分暴露在纳米材料巨大的比表面积上,可大大减少纳米印迹聚合物重结合模板分子过程中的传质阻力,增强吸附过程的动力学特征[21].Ciardelli等[22]采用反相法将乳液法制备的胆固醇分子印迹纳米粒子沉积在甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸共聚膜基质中,将具有特异性识别胆固醇分子的结合位点引入到共聚膜基质巨大的表面上,加快了胆固醇分子与其结合位点重结合的速率,不仅实现了体外血液中胆固醇分子的快速提取,还有效克服了体液中复杂基底对胆固醇识别的影响,为血液中胆固醇识别分析设备的构建以及相关心血管疾病的早期诊断提供了重要依据.Hoshino等[23]以蜂毒肽为模板分子,以丙烯类有机体分子为功能单体和交联剂,采用沉淀聚合法制备了蜂毒肽印迹纳米粒子,洗脱模板分子后形成蜂毒肽分子印迹空腔,利用生物素和亲和素作用,将生物素化的蜂毒肽分子连接到亲和素修饰的石英晶体微天平（QCM）电极表面,印迹纳米粒子表面的蜂毒肽分子印迹空腔与蜂毒肽分子特异性结合而被固定于QCM电极表面,引起QCM电极表面质量和频率的改变,通过对频率变化的测量实现对蜂毒肽分子的定量检测.由此合成的印迹纳米粒子体积较小,其在溶液中的传质阻力小,有利于对蜂毒肽分子的快速检测.近年发展起来的抗原表位印迹技术,以多肽或蛋白质序列中裸露的一个特异性短肽（抗原决定部位）为模板分子,采用合适的功能单体和交联剂合成聚合物,洗脱模板分子后留下的印迹腔可对整个多肽和蛋白质分子进行有效识别.抗原表位印迹聚合物中目标分子的嵌入具有特定的方向,避免了分子印迹过程中蛋白质大分子的嵌入,减少了MIPs与目标蛋白的非特异性吸附,而且,以小分子肽为模板分子,还能很好地解决以生物大分子为模板时印迹效率低和洗脱困难等问题.Rachkov等[24]以[Sar1, Ala8]血管紧张素II短肽为模板分子,采用抗原表位印迹技术在水相中合成分子印迹聚合物,该印迹聚合物不仅能选择性结合模板分子短肽,还能结合整个血管紧张素II分子,对血管紧张素II具有良好的识别特异性.Emgenbroich等[25]采用抗原表位印迹技术以9芴甲氧羰基磷酸酪氨酸甲酯（FmocpTyrOMe）为模板分子,以尿素、甲基丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯为共×