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;有特定功能(如:降解农药)的基因工程微生物,即遗传工程微生物(geicallyengineeredmicroanism,GEM)具有广阔的应用前景,然而,GEM的应用本身又有可能引发新的生态问题,这种潜在的危险性反过来限制了它的应用.为了研究如何最小化GEM应用的潜在风险,有必要建立用于环境中GEM的安全监测体系和在需要时能减少或消除其存在的主动生物防御(activebiologiccontainment,ABC)体系.

中科院动物研究所伍一军研究组利用双质粒表达系统成功构建了具有荧光特性和农药降解活性及可诱导性自杀能力的GEM.在该双质粒表达系统中有两个功能质粒:一个是用于ABC体系的自杀基因双拷贝质粒,另一个是与自杀质粒相容的带有荧光蛋白基因与农药降解酶基因的功能质粒.前者含有来源于Serratiamarcescens的去除前导肽的核酸酶自杀基因,该基因被构建到T7启动子下游,其表达受阿拉伯糖诱导,后者则是带有有机磷水解酶(anophosphorushydrolase,OPH)基因与绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因的质粒pL-EGFP-OPH,将其与自杀质粒共转于E.coliBL21AITM中得到GEB.通过荧光检测和酶活性检测以及可诱导性自杀能力的检测,证明该GEB不仅具有可供方便检测的荧光特性,而且还具有可诱导自杀能力,同时还具有较强的农药降解活性.具有自杀控制功能的安全型GEB的研究成功极大地提高了GEM在环境中实际应用的安全性.

以上研究结果发表在《应用微生物学与生物技术》(AppliedMicrobiologyandBiotechnology)杂志上:"QinLi,Yi-JunWu.Afluorescentgeicallyengineeredmicro-anismthatdegradesanophosphatesandmitssuicidewhenrequired."AppliedMicrobiologyandBiotechnology.2016,82(4):749-756.

该文第一作者为分子毒理学研究组李琴博士研究生,伍一军研究员为文章的通讯作者.该研究工作得到了国家高技术研究发展计划(863计划)(No.2002AA601160,No.2006AA06Z423)及中国科学院动物研究所知识创新工程(KSCX3-IOZ-0701)课题的资助.(来源:中国科学院动物研究所)

AppliedMicrobiologyandBiotechnology,Volume82,Number4/2016年3月10.1007/s00253-009-1857-3

Fig.1Constructionmapoftherebinantplasmid.aConstructionmapofthecontainmentplasmidpDS.ThetruncatednucleasegeneofSerratia,thesequenceofthekanamycinresistancegene,theT7promoter,andthefragmentofp15AoriginwereligatedtogethertogeneratetheplasmidpSS.Then,asecondcopyofthesequenceofthenucleasegeneandT7promoterwasclonedinpSStoformtheplasmidpDS.bTheconstructionmapoftheplasmidpL-EGFP-OPH.TheegfpgenewithoutthestopcodonwasinsertedintotheplasmidpBV220tomaketheplasmidpBV-EGFP.ThewholesequenceofpBV-EGFPexceptthecIts857genewasamplifiedbyPCRandself-circularizedtogeneratetheplasmidpL-EGFP.Then,theopdgenewasinsertedtoformtheplasmidL-EGFP-OPH.PRlambdaPRpromoter,PLPLpromoter,MCSmultiplecloningsites,oriorigin

Fig.2GrowthcurvesandintensityoffluorescenceofBL21AI-DS,BL21AI-SS,E.coliBL21AI,BL21AI-GOS,andBL21AI-GO.aGrowthcurvesofthebacteria.CulturesofBL21AI-DS,BL21AI-SS,andE.coliBL21AIweredividedintotwopartswhenthevalueofOD600wasbetween0.5and0.8.Thesuicideresponsewasinducedinoneofthesebyadding0.01%arabinose,whiletheotherwasanuninducedcontrol.TheOD600ofallculturesweremeasuredevery2hfor10hafterinduction.b,cGrowthcurves(b)andfluorescenceintensity(c)ofBL21AI-GOS,BL21AI-DS,andBL21AI-GO.CulturesofBL21AI-GOSandBL21AI-DSweredividedintotwopartswhentheiropticaldensity(OD600)wasintherangeof0.5–0.8.Thesuicideresponsewasinducedinonepart,whiletheotherservedasanon-inducedcontrol.Theopticaldensityandintensityoffluorescenceofallculturesweremonitoredevery1.5hwithaspectrophotometerandafluorescencespectrophotometer,respectively.Thearrowindicatesthestartpointofinduction

Fig.3PhotographsofBL21AI-GOS.a,bColoniesofBL21AI-GOS(a)andE.coliBL21AI(b)onLBagarplatesphotographedthroughafluorescentmicroscope(magnification,10×4).c,dColoniesofBL21AI-GOS(C)andE.coliBL21AI(D)onLBagarplatesphotographeddirectlyindaylight(AllphotosweretakenwithaNikon4500digitalcamera)

Fig.4WesternblottinganalysesofthetotalcellproteinofBL21AI-GOS.EqualamountsofthetotalcellproteinofBL21AI-GOS,BL21AI-GOorcellsharboringpL-EGFPandplasmid-freeE.coliBL21AIwereseparatedbySDS-PAGEanddetectedwithanti-GFPantibodyandanti-mouseIgGantibody.Lane1tolane4samplesofBL21AI-GOS,BL21AI-GOorcellsharboringpL-EGFPandplasmid-freeE.coliBL21AI,respectively

Fig.5DegradationofparathionbytotalcellproteinandwholecellsofBL21AI-GOS,BL21AI-GO,andplasmid-freeE.coliBL21AI.Theassayofbothtotalcellproteinactivity(TCP)andwholecellsuspensionactivity(WCS)wasperformedat30°Cfor2handtheamountofdegradationofparathionwasmonitoredcontinuously

格陵兰岛冰层下发现古老微生物

英国学术期刊日前刊登一项研究说,科研人员在格陵兰岛冰层下3000多米深处新发现了一种历史超过12万年的微生物,对其进行研究将有助于探索外星生命可能存在的形式.

据最新一期英国《国际分类进化微生物学杂志》报告,美国科研人员从格陵兰岛深挖出的冰芯中发现了这种处于休眠状态的微生物.科研人员先将其在2摄氏度条件下培养7个月,后又在5摄氏度条件下培养4个多月,终于使它复苏.

这种微生物群呈紫褐色,就个体而言,它非常小,只有大肠杆菌的十分之一到五十分之一.这样的大小使它得以在冰晶表面的液态薄膜等处生存,且营养吸收率高.

研究人员屈尔茨说,这种微生物可以在零下数十摄氏度,缺氧,高压的极端环境中存活,这与外星生命可能存在的环境非常相似,因此相关研究有助于探索外星生命可能存在的形式.

他还说,这种微生物可以穿过直径0.2微米的过滤孔,而这正是许多医院等场所使用的滤菌标准.尽管这种微生物对人完全无害,它也提醒人类要注意防范可能存在的相似大小的致病微生物.(来源:新华网)

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